تحقیق در مورد تکنیک PCR و کاربرد آن

اختصاصی از یارا فایل تحقیق در مورد تکنیک PCR و کاربرد آن دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

فورمت فایل:word(قابل ویرایش) تعداد14 صحفه

بدون تردید در بین روشهای مختلف مهندسی ژنتیک که به منظور تشخیص سریع عوامل بیماری‌زا مورد استفاده قرار می‌گیرند، تکنیک PCR 1 دارای جایگاه خاصی می‌باشد که علی‌رغم نوپا بودن در طی سالیان اخیر با پیشرفت چشمگیری همراه بوده است ] 1 [ .

این روش کاربردهای زیادی در جنبه‌های مختلف علوم بهداشتی و پزشکی به ویژه میکرب‌شناسی مواد غذایی دارد که از مهمترین آنها می‌توان به تشحیص سریع عوامل بیماری‌زا ( باکتریها، ویروس‌ها، انگل‌ها، قارچ‌ها) و سموم آنها اشاره نمود ] 5،2 [ .

این تکنیک از نظر اصول علمی تشابه زیادی به همانند سازی DNA داشته و در واقع برگرفته از آن است. هر سیکل PCR شامل مراحل مختلف دناتوره کردن DNA ، اتصال پرایمرها به هدف و پلیمریزاسیون و تکثیر قطعه هدف ( DNA یا RNA ) می‌باشد ] 7 [ .

روشهای متداول و مرسوم فعلی که در آزمایشگاه‌های مواد غذایی به منظور تشخیص عوامل و سموم ایجادکنندة عفونتها و مسمومیت‌های غذایی به کار می‌روند، دارای معایب بسیاری هستند؛ در حالیکه تکنیک PCR علاوه بر نداشتن این نقاط ضعف، داری محاسن زیادی است که از آن جمله می‌توان دقت و سرعت بالا، قدرت تشخیص طیف وسیعی از عوامل بیماری‌زا در مقادیر بسیار کم، و سادگی روش کار را نام برد ] 7،8 [ .

با توجه به حجم خرید بسیار زیاد انواع مختلف مواد غذایی در نیروهای مسلح و ضرورت وجود کنترل کیفیت میکروبی این مواد در کمترین زمان ممکن، می‌توان از روش PCR در تشخیص سریع عوامل میکروبی و سموم آنها به این منظور استفاده نمود.

مقدمه

در سالیان اخیر، مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی پیشرفت چشمگیری در زمینه بیولوژی مولکولی و ارائه روشهای جدید داشته است و محققان تمایل زیادی به استفاده از روشهای ژنتیکی برای تشخیص عوامل بیماری‌زا از خود نشان‌ داده‌اند.

PCR یکی از این روش‌های جدید است که علی‌رغم نوپا بودن، امید زیادی به استفاده از آن در زمینه‌های مختلف دارند و پیشرفت‌های شگرفی نیز در این راستا صورت گرفته است. حقیقت این است که تاحدود 30 سال پیش میلیونها کپی از یک ترادف 1 اسید نوکلئیک در آزمایشگاه 2 و یا همانندسازی از یک ترادف اسیدنوکلئیک در لوله‌ آزمایش، افسانه‌ای بیش نبود تا اینکه در سال 1971، Kleppe و همکاران اجزای اساسی و لازم برای تولید کپی‌های متعدد از یک ترادف اسید نوکلئیک در آزمایشگاه را تشریح نمودند و به دنبال آن در سال 1983 دانشمندان آمریکایی موفق به تولید میلیونها کپی از اسیدنوکلئیک در آزمایشگاه شدند و این فرآیند را واکنش زنجیره‌ای پلیمـراز « PCR » نامیدند. Saiki و همکارانش در سال 1985 اولین کاربرد علمی این تکنیک را به چاپ رساندند و Kary Mullis مخترع دستگاه PCR در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را به علت تحقیقات ارزشمند خود دریافت کرد (1،5،7). این تکنیک تمامی مشکلات پیشین در بیولوژی مولکولی را که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد DNA یکسان بود، برطرف نمود. به عنوان مثال در گذشته برای بدست آوردن نسخه‌های متعدد از یک ژن خاص، آن را به داخل حامل مناسب وارد می‌کردند. و سپس در یک باکتری تکثیر می‌نمودند در حالی‌ که امروزه با استفاده از PCR تکثیر نسخه‌های متعدد از یک ژن به سادگی و در اسرع وقت صورت می گیرد به طوری که می‌توان در عرض چند ساعت عامل بیماری‌زا را تشخیص داد ] 5،7 [ .

امروزه استفاده از این روش دارای طیف گسترده‌ای بوده و در جنبه‌های مختلف مهندسی ژنتیک، بیولوژی مولکولی، میکروب‌شناسی تشخیصی، تعیین هویت افراد (پزشکی قانونی) و حتی باستان‌شناسی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این تکنیک در میکروب‌شناسی مواد غذایی نیز دارای کاربرد بسیار زیادی بوده و امروزه بسیاری از عوامل مسمومیت‌زا و توکسین‌های باکتریایی و قارچی توسط این تکنیک سریع و دقیق مورد شناسایی قرار می‌گیرند. به علاوه امروزه موضوع جنگ‌های بیولوژیک و تهدیدات آن یکی از مباحث مهم در نیروهای نظامی به ویژه سپاه پاسداران می باشد که می‌توان از این تکنیک در تشخیص سریع آلودگی‌های آب و مواد غذایی آلوده استفاده نمود.

تکنیک PCR و مواد و وسایل لازم

PCR یکی از روش‌های ژنیتیکی و نوترکیبی DNA 3 است که در آن قسمتی از رشته و زنجیره DNA پلی‌مریزه و بزرگ می‌گردد و برای انجام این واکنش به یک سری مواد و وسایل نیاز است که عبارتند از:

1. DNA یا RNA الگو 4 : برای انجام واکنش زنجیره‌ای، ابتدا بایستی قطعه مورد نظر ( DNA یا RNA ) را در اختیار داشته و اسیدنوکلئیک ( N.A ) آن تخلیص گردد که این عمل با استفاده از روش‌های مختلفی نظیر جوشاندن 5 ، انجماد، استفاده از آنزیم پروتئاز به همراه بافر لیزکننده 6 صورت می‌گیرد.
2. پرایمر 7 : پرایمرها قطعات سنتز شده‌ای از بازهای آلی هستند که براساس قطعه مورد نظر الگوهای هدف ساخته می‌شوند.کار پرایمرها این است که به رشته مخالف خودشان در دوانتهای DNA تک رشته‌ای متصل می شوند و سپس با استفاده از آنزیم DNA پلی‌مراز، این قسمت از DNA ، بزرگ و تکثیر می‌گردد. توالی ردیف‌های نوکلئیدها در پرایمر باید به دقت انتخاب شود. اولین سیکل برای ادامه واکنش، بسیار مهم و اساسی است زیرا این سیکل، الگو را برای سیکل بعدی فراهم می‌کند. معمولاً بین 20 تا30 نوکلئوتید (قطعات کوچکتر پرایمر) برای تشخیص به کار می‌رود.
3. آنزیم تک‌پلی‌مراز 1 : این آنزیم وظیفه بزرگ کردن و تکثیر قطعه مورد نظر DNA را بر عهده دارد. قبل از کشف این آنزیم، مرحله بزرگ کردن و تکثیر الگوی مورد نظر به علت وجود دمای بالا در این مرحله oC (ْ75) با مشکلات زیادی به همراه بود به طوری‌که پس از هر بار دناتوره کردن DNA ، آنزیم تازه‌ای به مخلوط واکنش اضافه می‌شد، ولی با کشف نوعی باکتری دریایی گرما دوست به نام ترموس آکواتیکوس 2 و استخراج آنزیم تک‌پلی‌مراز از آن ، مشکل فوق مرتفع گردید . امروزه از این آنزیم برای تکثیر و ازدیاد قطعه مورد نظر استفاده می‌گــــردد ] 6،4 [ .
4. بازهای سازنده DNA (داکسی نوکلئو زیدتری فسفات 3 ): این بازها شامل آدنین ، سیتوزین، گوانین و تیمین می‌باشند. یک PCR به طور طبیعی با غلظت 100 میکرومول از (MM) از DNTP انجام می‌شود. اگر چه در غلظت‌های پایین‌تر دارای مقدار بالاتری است، با این وجود غلظت DNTP بستگی به غلظت بافر، غلظت پرایمر، طول محصول تکثیر شونده و مقدار سیکل‌های PCR دارد و بهترین حالت زمانی است که غلظت DNTP به طور تجربی تعیین شود ] 4،1 [ .
5. الکتروفورز ژل‌آگارز 4 : الکتروفورز وسیله‌ای است که برای جداسازی قطعات بزرگ DNA که دارای واحد سایز بین 800 تا 2000 جفت باز متغیر است، به کار می‌رود و اساس کار آن حرکت مولکول‌های DNA با بار منفی در یک میدان الکتریکی براساس وزن مولکولی آنهاست . روش کار به این صورت است که ابتدا پس از ریختن ژل آگارز در داخل قالب مربوطه، پروتئین مجهول (یا قطعه مورد نظر) را که باید اسید آمینه‌های آن شناسایی گردند، وارد دستگاه می نمایند. این دستگاه توسط دو الکترود به برق متصل شده و مولکول‌های DNA که دارای بارمنفی هستند، براساس وزن مولکولی خود از قطب منفی به سمت قطب مثبت حرکت می‌کنند. پس از خارج شدن مولکولها و مقایسة اندازه و سایز آنها با استاندارد‌ها، نوع اسیدآمینه و نوع پروتئین تشخیص داده می‌شود. محصولات PCR نیز بوسیلة الکتروفورز ژل‌آگارز، در حضور شاهد مناسب تجزیه شده و بعد از رنگ‌آمیزی با اتیدیوم‌بروماید توسط تاباندن اشعه ماوراء بنفش به ژل و انعکاس درخشش فلوئورسانس قابل مشاهده می گردنــد ] 7،2 [ .
6. نمایشگر(شاخص) : پس از الکتروفورز، حاصل واکنش را به روی فیلترهای غشایی نیتروسلولز انتقال می‌دهند و با پروب‌های 5 آماده که غالباً دارای الیگونوکلئوتید‌های نشاندار هستند، شناسایی می‌کنند. به طور کلی استفاده از پروب‌های آماده DNA یکی از روش‌های مناسب برای تشخیص میکروب‌ها به شمار قطعه کوچکی از DNA یا RNA تک‌رشته‌ای را به صورت پروب درآورده در اختیار دارند که توسط مواد رادیواکتیو یا آنزیم نشان‌دار شده‌اند. معمولاً این پروب‌آماده را روی فیلترهای غشایی در مجاورت قطعه DNA میکروب مجهول قرار می‌دهند و چنانچه این دو قطعه همولوگ 1 باشند (و با یکدیگر جفت شوند) و هیبرید 2 تشکیل دهند، از فیلترهای غشایی عبور نکرده و بدین شکل میکروب مورد نظر شناسایی می‌گردد . چنانچه هیبرید تشکیل نگردد، قطعه DNA تک رشته‌ای از فیلتر عبور خواهد کرد.
7. بافر : برای انجام واکنش PCR می‌توان از بافرهای مختلفی استفاده نمود که متداول‌ترین آنها بافری است که به شکل X 10 وجود دارد که شامل 100میکرومول تریس اسیدکلریدریک 3 با 3/8 = PH ، 500 میکرومول پتاسیم کلرید، 15 میکرومول منیزیوم کلرید و 1/0درصد ژلاتین می‌باشد ] 6،3،1 [ .

روش کار PCR

در این روش با استفاده از پرایمرها و آنزیم تک‌پلی‌مراز، قسمتی از ژن یا DNA دو رشته‌ای را در داخل دستگاه PCR تکثیر و پلی‌مریزه می‌کنند. در واقع تکثیر و ازدیاد محصول PCR توسط پرایمرهای اولیگونوکلئوتید سنتز شده صورت می‌گیرد و اندازة تکثیر سکانس یا قطعه مورد نظر، بستگی کامل به فاصلة بین دو پرایمر پیوندشده به زنجیره دارد و تعداد سیکل‌های تکراری نیز در مقدار تولید نقش بسیار مهمی دارند . به طور کلی هر سیکل PCR شامل چند مرحله است:

• 1. دناتوره کردن 4 : در این مرحله قطعه DNA مورد نظر را که به صورت دورشته‌ای می‌باشد (رشته الگو) را در دمای c ْ95-90 دناتوره کرده و از حالت دورشته‌ای در می‌آورند. بهترین درجه حرارت پیشنهاد شده برای دناتوره کردن، oC ْ94 به مدت 1 دقیقه است ] 5،1 [ .

1. اتصال پرایمرها به هدف 5 : در این مرحله پرایمرها را به دو انتهای DNA تک رشته‌ای متصل می‌کنند که با سرد کردن مخلوط واکنش در دمای oC 60-40 انجام می گیرد. مدت زمان مناسب برای اتصال محکم پرایمرها به قطعه مورد نظر 45 ثانیه در oC ْ54 پیشنهاد گردیده اسـت ] 5 [ .
2. مرحله گسترش دادن و بزرگ کردن 6 : پس از اتصال پرایمرها به دو انتهای DNA هدف، دما را به oC ْ72 می‌رسانند و سپس با استفاده از آنزیم مقاوم به حرارت به نام تک‌پلی‌مراز، DNA هدف را بزرگ و تکثیر می‌کنند و به این شکل از یک قطعه، دو قطعه و از دو قطعه، چهار قطعه و … نهایتاً با سرعت خیلی زیاد یک قطعه کوچک DNA را بزرگ کرده و به راحتی تشخیص می‌دهند (35 سیکل) یک واکنش موفق PCR ، قادر به تولید 10 12 مولکول DNA در 1/0 میلی‌لیتر از واکنش می‌باشد ] 6 [ .

کاربردهای PCR

PCR دارای کاربردهای زیادی در عرصه‌های مختلف بیولوژی، بیوتکنولوژی، مهندسی ژنتیک، جرم‌شناسی و … می باشد. علت اصلی کاربردهای زیاد آن این است که DNA الگوی به کار رفته در PCR را می‌توان از منابع مختلف تأمین و تکثیر نمود ] 7،2 [ .

مهمترین موارد کاربرد این تکنیک عبارتند از:

1. تشخیص سریع عوامل بیماری‌زا: یکی از مهمترین و متداول‌ترین کاربردهای PCR ، تشخیص سریع و دقیق عوامل بیماری‌زای میکروبی (باکتریها، ویروس‌ها، قارچ‌ها، انگل‌ها) و توکسین آنها می‌باشد. عوامل میکروبی که با این تکنیک قابل تشخیص می‌باشند، که در جدول «1» آمده است. روش کار به این صورت است که ابتدا DNA باکتری مورد نظر با استفاده از حرارت و یا مواد شیمیایی جدا نموده و سپس با استفاده از کیت‌های آماده آن را تکثیر و بزرگ می‌نمایند و به راحتی تشخیص می‌دهند (تصویر شماره1).

روش‌های فعلی مورد استفاده برای تشخیص بیماری‌های عفونی، به کار می‌روند براساس آزمایشاتی پایه‌ریزی گردیده‌اند که خصوصیات فنوتیپی میکروبها نظیر شکل، رنگ، اندازه، نوع حرکت، میزان مقاومت در برابر PH و نمک … را به تصویر می‌کشند و اطلاعات زیادی در مورد خصوصیات ژنوتیپی میکروبها در اختیار ما نمی‌گذارند. این روش‌ها با وجود ارزش‌هایی که دارند، دارای معایبی هستند که از آن جمله می‌توان به این موارد اشاره نمود:

•   1. کشت و تشخیص عوامل بیماری‌زا در محیطهای کشت مستلزم صرف زمان زیادی است. به عنوان مثال تشخیص عوامل بیماری سل و سالمونلوز چندین روز به طول می‌انجامد.
• 2. در مورد برخی از میکروبها نظیر ویروس هپاتیت، ویروس فلج اطفال و … سیستم کشت روتین وجود ندارد و تشخیص آنها با روشهای موجود امکان پذیر نیست.
• 3. برخی میکروبها در محیط‌های کشت به سختی رشد می‌نمایند و برای رشد به مواد غذایی خاصی نیاز دارند بنابراین جدا نمودن آنها در آزمایشگاه با مشکلات زیادی همراه است که از آن جمله می‌توان به بروسلا آبورتوس 1 ، مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 2 و مایکوپلاسما پنومونیه 3 اشاره نمود.

1. هزینه جداسازی و تعیین هویت برخی از میکروبها نظیر کوکسیلابورنتی 4 ، یرسینیا پستیس 5 و … بسیار بالا می‌باشد.
2. حتی در بهترین شرایط، تنها درصد کمی از جمعیت میکروبی یک نمونه قادر به رشد در آزمایشگاه می باشند.

با توجه به وجود این مشکلات ، جایگزین نمودن و استفاده از روشها و تکنیک‌های جدید نظیر PCR ، برای تشخیص عوامل بیماریزا کاملاً ضروری و اجتناب ناپذیر است.تکنیک PCR علاوه بر نداشتن مشکلات فوق، دارای محاسن زیر می‌باشد ] 8،7،3 : [

• 1. قدرت تشخیص و شناسایی طیف وسیعی از عوامل میکروبی (باکتری‌ها، ویروس‌ها، تک‌یاخته‌ها و قارچ‌ها) و سموم آنها.
• 2. داشتن قابلیت تکرار.
• 3. دقت و سرعت بالا .
• 4. سادگی روش کار .
• 5. عدم وجود واکنش متقاطع بین عوامل میکروبی .
• 6. قدرت تشخیص عامل در نمونه‌های مختلف مرضی و محیطی.
• 7. قدرت تشخیص عامل در مقادیر بسیار کم.

با توجه به مطالب فوق، می‌توان دریافت که بدون هیچگونه شک و تردید این روشهای مدرن و جدید بایستی جایگزین روش‌های سنتی و متداول امروزی گردند.

جدول شماره 1: لیست عوامل میکروبی (باکتریها ، ویروسها، انگل‌ها، قارچ‌ها) که به وسیله تکنیک PCR شناسایی گردیده‌اند(1) :

الف) باکتریهای بیماریزا:

Bacterial Pathogen

Mycobacterium sp.

Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium leprae

Mycobacterium avium-intracellulare

Chlamydia trachomatis

Borrelia burgdorferi

Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma sp.

Mycoplasma fermentans

Salmonella typhimurium

Bordetella pertussis

Legionella pneumophila

Clostridum difficile

Treponema pallidum

Enterotoxigenic escherichia coli

Enterohemorrhagic escherichia coli

Vibrrocholerae

Shigella sp.

Rickettsia sp.

Ehrlichia sp.

Chlamydia pnemumiae

Staphylococcus aureus

Staphylococcos aureus toxins

Bacterial meningitis pathogens

Whipple's disease – associated bacterium

Yersinia pestis

Yersinia enterocolitica

Helicobacter pylori

Aeromonas hydrophila

Bacillary angiomatosis agent

Listeria monocytogenes

Comamonas sp.

Bacillus anthracis

Coliform bacteria

Ureaplasma urealyticum

Neisseria meningitidis

Neisseria gonorrhoeae

Mycoplasma genitalium

Camphylobacterium sp.

Corynebacterium diphtheriae

Aotinobacillus pleuropnemoniae

Leptospira sp.

Haemophilus influenzae

Propionibacterium acnes

Bacteriodes fragilis

Haemophtlius ducreyl

Porphyromonas gingivalis

Bartonella bacilliformis

ب) ویروسهای بیماریزا

Viral pathogen

Hepesviride

Herpes simplex virus types I and II

Epstein- Barr virus

Cytomegalovius

Varicella – Zoster virus

Human herpesviruses 6 and 7

Papovaviridae

Human JC Virus

Human papillomavirus

Flaviviridae

Hepatitis C virus

Enteroviruses

Hepadnaviridae

Hepatitis B virus

Retruviridae

HIV-I and HIV-II

HTL . V – I and HTL V-II a

1. V b

Orthomyxoviridae

Influenza virus

Parvoviridae

Human Parvovirus B 19

Adenoviridae

Human adenovirus

Togaviridae

Rubella virus

Picornviridae

Rhinovirus

Hepatitis A virus

a:HTL V . human T-cell leukemia virus; b:HBL V, Human B-lymphototropic virus

ج) تک یاخته‌های بیماریزا

Protozoal pathogen

Babesia bigemina

Babesia bovis

Babesia microti

Entamoeba histolytica

Giardia lamblia

Leishmania sp.

Naegleria fowleri

Plasmodium falciparum

Toxoplasma gondii

Trichomonas vaginalis

Trypanosoma sp.

د) قارچهای بیماریزا

Fungal pathogen

Blastomyces dermatitidis

Candida albicans

Coccidioides immitis

Cryptococcus neoformans

Hictoplasma capsulatum

Pneumosystis carinit

Trichosporon beigelii

تشخیص بیماری‌های ژنتیکی قبل از تولد: (Prenatal diagnosis)

بسیاری از بیماری‌های ژنتیکی در جنین مانند هموفیلی و تالاسمی، ناویسم، فنل‌کتون‌اوری … را در دوران حاملگی می‌توان با استفاده از این تکنیک تشخیص داد . روش کار به این صورت است که مقداری از سلول‌های جنینی را استخراج کرده و با پرایمر اختصاصی آن ژن مولد بیماری، مجاور می‌کنند. برای کنترل آزمایش آن را به طور جداگانه با ژن سالم نیز مجاور کرده و PCR را انجام می دهند. پس از پایان PCR حالات مختلفی پیش خواهد آمد بدین صورت که چنانچه در هر دو لوله سنتز DNA انجام گیرد جنین دارای یک ژن سالم و یک ژن بیمار است (یعنی حامل می‌باشد و بیمار نیست). اگر سنتز DNA فقط در لوله‌ای که شناساگر مخصوص ژن بیمار وجود دارد، انجام گیرد، جنین بیمار بوده و باید سقط شود. اگر سنتز DNA فقط در لوله‌ای که حاوی شناساگر ژن سالم است انجام گیرد، جنین کاملاً سالم است ] 1،7 [ . لازم به ذکر است که علاوه بر موارد فوق از تکنیک PCR در تعیین جنسیت جنین، تشخیص سرطان، و تعیین هویت افراد (پزشکی قانونی) نیز استفاده می گــردد ] 2،7،5 [ .

نتیجه‌گیری

امروزه روش‌ها و تکنیک‌های جدید حاصل از مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی به تدریج جایگزین روشهای سنتی و متداول گردیده‌اند. تکنیک PCR به عنوان یکی از جدیدترین روشهای تشخیص سریع مولکولی مطرح گردیده است و از آن در شاخه‌های مختلف علوم پزشکی از جمله میکروب‌شناسی و بویژه میکروب‌شناسی غذایی استفاده می‌گردد. ویژگی‌ها و خصوصیات زیاد این تکنیک از جمله سرعت و دقت بالای آن در تشخیص عوامل و توکسین‌های ایجادکننده مسمومیت‌های غذایی خطرناک در مقایسه با روش‌های معمول و متداول مورد استفاده در آزمایشگاهها، باعث گردیده است تا محققین به تدریج آن را جایگزین روش‌های سنتی نمایند. امروزه در بسیاری از مراکز تحقیقاتی از این روش برای تشخیص ارگانیسم‌های مختلف ( باکتریها، ویروسها، انگل‌ها و قارچها) استفاده می‌گردد. همچنین از این تکنیک در تشخیص بیماریهای ژنتیکی قبل از تولد، تعیین جنسیت جنین، تشخیص سرطان‌ها و تعیین هویت افراد، استفاده گردیده است.