دانلود پایان نامه کارشناسی ارشد بخش بیوتکنولوژی با عنوان مقدمه ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی

اختصاصی از یارا فایل دانلود پایان نامه کارشناسی ارشد بخش بیوتکنولوژی با عنوان مقدمه ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : word(قابل ویرایش)

تعداد صفحات:53

فهرست مطالب:

بخش اول: دست کاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه…………………………………

1-1- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان…….

2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باکتری……

3-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکروپیپت …….  

4-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با انکوبه کردن آن در سیستم بافری …….  

5-1- انقال ژن از طریق اسپرم با الکتروپورشن در سیستم بافری…….   

6-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق الکتروپورش …….

7-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکرواینجکشن…….

8-1- بررسی امکان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد…….  
بخش دوم : دست کاریهای کروموزومی در ماهیان

1-2- دست کاریهای جنسی…………………..

1-1-2- دست کاریهای جنسی با تکنیک ژینوژنز….

2-1-2- دست کاریهای مجموعه کروزومی به وسیله تکنیک اندروژنز …….  

2-2- پلوئیدی…………………………..

1-2-2- تریپلوئیدی………………………

2-2-2- تتراپلوئیدی……………………..
بخش سوم: کلونینگ

مقدمه…………………………………

1-3- ایجاد کلون به وسیله دوژینوژنز متوالی…

2-3- کلون کردن به وسیله ترکیبی از اندروژنز و ژینوژنز…….

3-3- جابجایی هسته………………………

4-3- جابجایی سلولهای سوماتیک جنینی به جنین دیگر…….

5-3- دورگه گیری………………………..

4- منابع …….

 

بخش اول: دست کاریهای ژنی در ماهیان

مقدمه:

یکی از زمینه های که امروزه بیوتکنولوژیست ها روی آن تحقیق می کنند ایجاد گونه های ترانسژنیک است. طبق تعریف ترانسژنیک موجودی است که، دارای DNA نو ترکیبی باشد. به طوری که در ژنوم آن موجود ژن نو ترکیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یکی از جنبه های تولید ترانسژنیک و انتقال DNA به زاده های هدف بعدی می باشد. در این زمینه تکنیک میکرواینجکش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همکاران در سال 1980 گزارش شد. در این تکنیک یک لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد کردن DNA نو ترکیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به کار گرفتند. در همین سال میکروانجکش مستقیم DNA نو ترکیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیک مورد استفاده قرار گرفته است. طوری که ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سرکه، خرگوش و خوک کرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همکاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مرکزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق کردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده کرند. در همین سال روکونس (Rokkones) تکنیک میکرواینجکشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تکنیک ابتدا به کمک یک وسیله نوک تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA نو ترکیب به کمک پی پت ریز تخم شدند به طوری که به کیسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسمیدهای کامل را مشخص کردند. چوروت (Chourrout) و همکاران در سال 1986 روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به کار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملکولهای DNA میزبان پیشنهاد شده که این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از جمله با تریپسن کوریون را برداشته و تزریق میکرواینجکشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی کوچک مدوکا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیک مطرح کرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن کریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میکرواینجکشن وارد کرد. به علت کوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میکرواینجکشن مشکل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور روشهایی جهت غلبه بر این مشکل به کار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بریم (Brem) و همکاران ژن هورمون رشد انسان را به کمک وکتور مناسب از طریق میکروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق کردند و رشد بچه ماهیان طی 90 روز بررسی شد. مشابه این تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همکاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیک انجام شد. همچنین تکنیکهای دیگر شامل الکتروپورشن (Electroporation) شلیک ذرات ژن Shatagun بر روی تخمک و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میکر واینجکشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن کم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیک است علاوه بر این از دیگر مشکلات آن این است که در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میکرسکوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم تزریق می کنند.

در مجموعه تحقیقات انجام شده، میزان باقی ماندگی جنین هایی که مورد تزریق قرار گرفته اند بین 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و کارآیی میزان بیان ژن بین 3 تا 70 درصد بوده است. باقی ماندگی جنین ها و کارایی بیان ژن وابسته به فاکتورهایی نظیر سیستم بافری، غلظت DNA و روش های مورد استفاده در تزریق می باشد. لذا در مراحل بعدی غلبه بر این مشکلات مورد توجه قرار گرفت به طوری که ضمن ساده کردن تکنک و کم کردن هزینه ها کارآیی را افزایش می دهند تا در عمل بتوان در تکنولوژی تکثیر و پرورش آبزیان تعداد زیادی از ماهیان ترانسژنیک را ایجاد کرد. بنابراین روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بکارگیری اسپرم به عنوان یک ناقل مسئله جدیدی نیست بلکه در سال 1971 براکت (Brackett) با وارد کردن ژن خارجی به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فریمن (Fareeman) بر روی ماکیان این تحقیق را انجام داده اند و در سال 1989 لویترانو (Lavitrano) این تکنیک را بر روی موش به کار گرفته است. در سال 1992 کهو (Khoo) تکنیک استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد کردن ژنهای جدید به ماهی زبر به کار گرفت. همچنین در سال 1993 ایکسی (Xie) و همکاران جزئیات انتقال ژن از طریق اسپرم به کمک التروپورشن (Electroporation) بر روی ماهیان لوچ (Loach) و کاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سین) Sin و همکاران انتقال ژن به ماهی چنوک (Chinook) را با همین تکنیک شرح دادند. در این نوشتار جزئیات دستکاریهای ژنی در ماهیان با ذکر مثالهایی بررسی شده است.

1-1- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان

گزارشهای اندکی در ارتباط با تحقیقات به کارگیری پروموتر از ماهی در دسترس است. در ماهی قزل آلای رنگین کمان دو فرم مشابه از ژنهای متالوتیونین بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بیان ژن گزارشگر در محیطهای کشت سلولی است. ولی درباره این ویژگی پروموترژن B در سلولهای ماهی اطلاعات کمی وجود دارد. به منظور طراحی و کتورهای مناسب برای ما هی و مطالعه تنظیم بیان ژن در داخل بدن و شرایط آزمایشگاهی پروموترن ژن B متالوتیونین ماهی قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بیان ژن در لاینهای سلولی انسان و ماهی توسط هونگ (Hong) به کار گرفته شد. به همین منظور وکتور بنام PtMTb – CAT که دارای 6/4 کیلوباز است طراحی گردید. حدود 261 حفت باز وکتور مربوط به پروموترژن B متالتیونین قزل آلای رنگین کمان (tMTb) کیلو باز آن ژن کلرامفنیکل استیل ترانسفراز (CAT) و سیگنال پلی ادنیلاسیون ویروس SV40 و همچنین 7/2 کیلو باز آن قطعه ای مربوط به پلاسمید PUC18 بوده است همچنین طراحی آن بر پایه ساختمان pBL – CAT تکمیل شده بود. به طوری که طراحی BL پرایمری دارای سکانس اولیگونکلئوتیدی بر اساس ردیف نکلئوتیدهای سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهی قزل آلا بوده و دارای محل ویژه ای جهت برش توسط آنزیم EcoRI بوده است. همچنین در ساختمان پلاسمید ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازی پروموتر tMTb در جلوی ژن CAT در ساختمان CAT pBL- قرار گرفته است. در کنار این چهار وکتور دیگر طراحی گردید، که شامل pBL-CAT2-1 که در آن پروموتر تیمیدین کیناز (TK) ویروسی در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT3-2 بر اساس pBL-CAT2 که در آن پروموتر TK برداشته بود طراحی شد pTK-CAT2E-3 که در پلاسیمید PBL-CAT2 تعداد 72 جفت باز تکراری از اینهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتدای ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 که تعداد 850 جفت باز دارای محل ویژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتیونین IIA انسانی (HmtIIA) به ژن CAT در ساختمان
pBL-CAT3 اضافه شده بود این وکتورها به روی 4 لاین سلولی ماهی و یک لاین انسانی به کار گرفته شدند. طوری که در آن سلولها با میزان 5/3 پیکومولار از DNA پلاسمید آلوده شدند جزئیات نتایج در جدول شماره یک آمده است.  

جهت بررسی اثرالقاء فلزات بر روی ژن، لاین های سلولی ماهی آلوده با پلاسمید ptMTb- phMTIIA – CAT , CAT برای مدت 48 ساعت قبل از برداشت، تحت اثر ZnCI2 یا CdCI2 قرار داده شدند. سنجش CAT بر طبق روش فریدین ریچ (Friedenreich) در سال 1990 انجام شده که در آن فعالیت پروموتر به وسیله درصد تبدیل CAT با مقایسه استیل کلرامفنیل (3-Ac) و کلرامفتیکل (Cm) به شرح زیر تعیین شد.

پروموتر tMTb در تمام لاین های سلولی به جز لاین سلولی PSM فعال بوده است. بنابراین القاء ناشی از فلزات بر روی پروموتر tMTb بستگی به منشاء سلولها و نوع آنها دارد علاوه بر این در بین چهارلاین سلولی بیشترین القاء در فعالیت پروموتر در لاین سلولی RTH بوده است و لاینهای A2 , EPC در مراتب بعد قرار داشتند. این نتایج در کنار این حقیقت که در مهره داران سنتز عمده متالوتیونین در کبد اتفاق میافتد نشانگر این است که، این تکنیک میتواند روشی برای ابزار ژن متاتیونین در سایر انواع سلولها باشد. همچنین پلاسمید tMTb= CAT‍‍‍‍ ‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍p را به سیتوپلاسم یکی از دو سلول مرحله جنینی ماهی مدوکا از طریق میکرواینجکش تزریق کردند و مشاهده شد که ژن CAT در تعداد محدودی از جنین ها براز شده است. تحقیقات هونگ و همکاران نشان داد که، پروموتر ماهی در سلولهای ماهی کارایی بیشتری از سایر سلولها نظیر انسان داشته استم. محدودیتهای زیادی در استفاده از پروموترهای چند گانه غیر متجانس (Heterologous) برای مطالعات ابزار ژن در شرایط زیستی و آزمایشگاهی در زمینه تولید ماهیان ترانسژنیک وجود دارد. با توجه به اینکه پروموتر tMTb نقش غیر محسوسی در بیان ذاتی ژن داشته است طوری که تحت اثر فلزات سنگین القاء شده و سبب ابزار ژن گزارشگر می شود. این پروموتر، برای ایجاد ماهیان ترانسژنیک با ژن ساختمانی شناخته شده و فهم عمل ژنهای جدید مناسب است.