بیماری کیست هیداتیک یکی از مهمترین زئونوزهای انگلی است که در مناطق مختلف دنیا از جمله ایران شیوع دارد. استفاده از روش های سرولوژیکی که بتواند با حساسیت و ویژگی بالایی در تشخیص هیداتیدوز بکار رود ارزشمند می باشد. از این روی در این پژوهش، انتی ژن B و آنتی ژن پروتواسکولکس بعنوان دو آنتی ژن اختصاصی انگل، تخلیص شده و سپس با تست دات بلاتینگ با سرم بیماران هیداتیدوزی و غیر هیداتیدوزی مورد ارزیابی قرار گرفته است تا حساسیت و ویژگی این دو آنتی ژن با این روش معرفی گردد.
روش کار: در یک مطالعه تحلیلی مقایسه ای از 22 بیمار تحت عمل جراحی کیست هیداتیک و 12 بیمار غیر هیداتیدوزی نیز که مبتلا به توکسوپلاسموز حاد (4نفر). لیشمانیوز (4نفر) و سستودهای غیر کیست هیداتیک (4نفر) بودند و همچنین 4 فرد نرمال به عنوان سرم کترل، خون گیری به عمل آمد. مایع کیست هیداتیک کبد وریه گوسفند حاوی پروتواسکولس استخراش شده و سپس این مایع جهت تهیه آنتی ژن B تحت تخلیص نسبی و عبور از ستون پروتئینA قرار گرفت و محتوای سلولی پروتواسکولکس نیز تحت عنوان آنتی ژن پروتواسکولکس تهیه شد. با متد دات بلات آنتی ژن های B و پروتواسکولکس با سرم های هیداتیکی و کنترل واکنش داده و حساسیت و ویژگی این آنتی ژن ها ارزیابی گردید.
نتایج: نتایج حساسیت و ویژگی آنتی ژن B به ترتیب 9/90% و 81% و آنتی ژن پروتواسکولکس به ترتیب 100% و 63% در متد دات بلات برآورد شد.
نتیجه نهائی: ارزیابی حساسیت و ویژگی آنتی ژن B و آنتی ژ« پروتواسکولکس با استفاده از دات بلاتینگ نشان داد آنتی ژن B از ارزش بالایی در تشخیص هیداتیدوز برخوردار است و دات بلاتینگ با استفاده از آنتی ژن B می تواند به عنوان یک روش تشخیصی ارزشمند بکار گرفته شود.
کلید واژه ها: آنتی ژن بی / آنتی ژن پروتواسکولکس / ایمنوبلاتینگ / کیست هیداتیک
کیست هیداتیک که توسط مرحله لاروی سستود سگ و سگ سانان به نام Echinococcus granulosus ایجاد می شود یکی از مهمترین زءونوزهای انگلی است که در مناطق مختلف دنیا نظیر اروپا، آسیا مرکزی، چین، استرالیا، افریقا، امریکا و خاورمیانه از جمله ایران شیوع دارد (1.2).
ایران از مناطق هیپروآندمیک بیماری بوده و موجب ضررهای اقتصادی به دلیل آلودگی در دام و آسیب های شدید جسمی، روانی و اقتصادی به دلیل آلودگی انسان می شود (3). تشخیص و تفسیر بالینی هیداتیدوز بیشتربر اساس تصاویر رادیولوژیک، سیتی اسکن یا سونوگرافی می باشد که با مشکلاتی همراه بوده و در تشخیص دقیق ماهیت این ضایعات ناتوان است (4). بنابراین روش های ایمونولوژیک در تشخیص آزمایشگاهی هیداتیدوز از اهمیت و اعتبار ویژه ای برخوردارند.
تقریباً اکثر آزمایشات رایج سرولوژیک از قبیل
Casoni و (Complement Fixation Test(CFT
(Indirect Hemmaglutination Antibody Test (IHA
(Latex Agglutination (LA
(Immuno Fluorescent Antibody Test (IFAT
(Counter Immuno Electrophoresis (CIEP
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA
از آغاز تا به امروز برای تشخیص این بیماری بکار رفته اند (5). در کشور ما نیز بطور معمول، روش IFAT در آژمایشگاهها انجام می شود که دارای مثبت و منفی کاذب می باشد و علاوه بر آن در شرایط خاص، جدید نمودن بیماران هیداتیکی که بیماری آنها با کیست جدید مجدداً فعال شده باشد، از بیماران جراحی شده فاقد کیست جدید مشکل بوده و روشIFAT فاقد امان تمایز اینگونه بیماران است زیرا با این روش ا«تی بادی که بر ضد مجموعه آنتی ژن پروتواسکولکس وجود دارد، اندازه گیری می شود که برای کل بیماران هیداتیدوزی تا مدتها پس از عمل نیز مثبت کاذب نشان میدهد. همچنین مایع کیست که به طور ممعمول به عنوان آنتی ژن در روشهایی که نام برده شد مورد استفاده قرار می گیرد، دارای اجزا و ترکیبات مختلفی است که بعضی از آنها فاقد حساسیت و ویژگی لازم می باشند (6). بنابراین لزوم تائید بیماری توسط یک تست سرولوژی دقیق امری ضروری به نظر می رسد. در این راستا تعیین آنتی ژنی که از نظر ویژگی و حساسیت بتواند چنین هدفی را برآورده کند از اهمیت خاصی برخوردار است. از این رو در این پژوهش، آنتی ژن B و آنتی ژن پروتواسکولکس بعنون دو آنتی ژن اختصاصی انگل انتخاب شده و سپس توسط دات بلاتینگ ارزیابی گردیدند.
روش کار:
این مطالعه از نوع تحلیلی مقایسه ای بود که در آننمونه های مورد آزمایش عبارت بودند از نمونه های مایع هیداتیک (آنتی ژن) و نمونه های سرمی (آنتی بادی). پس از تشخیص گوسفند آلوده به کیست هیداتیک، در کشتارگاه خوراسگان در حومه اصفهان کبد و ریه آلوده را انتخاب کرده و پس از انتقال به بخش انگل شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان مایع کیست جمع آوری گردید. مایع هیداتیک سانتریفوژ شده و محلول رویی در دمای 70- درجه نگهداری گردید. پس از این که پروتواسکولکس ها با رسوبات دیگر از مایع جدا گردید 2 یا 3 بار در بافر PBS (Phosphate Buffer saline) با pH=7.4 شستشو داده شده و سپس در دمای 70- درجه فریز گردید.
تهیه سرم های انسانی: در مجموع 38 مورد سرم جمع آوری و آزمایش شدند که شامل: 22مورد سرم از بیماران مبتلا به کیست هیداتیک که ابتلای آنها بعد از عمل جراحی با آزمایش انگل شناسی و یا بافت شناسی ضایعه به اثبات رسیده بود. 4 مورد توکسوپلاسموزیس حاد، 4 مورد مبتلا به سستودهای غیر از اکینوکوکوس گرانولوزوس (1مور تنیا ساژیناتا و 3 مورد هیمنو لیپیس نانا) و 3 مورد لیشمانیوز جلدی و 1 مورد کالاآزار و 4 مورد سرم از افراد سالم جهت ارزیابی واکنش های متقاطع و غیر اختصاصی تهیه شدند.
تهیه و تخلیص آنتی ژن (Ag B) B از مایع کیست هیداتیک:
100 میلی لیتر مایع هیداتی سانتریفوژشد. بعد از حذف رسوبات، مایع حاصل به مدت یک شب درمقابل بافر استات 005/0 مولار 5= pH در دمای 4 درجه سانتی گراد دیالیز گردیده و سپس محتویات کیسه دیالیز با اولتراسانتریفوژ g ×50000 در شرایط خلاء و دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ شد. رسوب حاصل از مرحله فوق با 10 میلی لیتر بافر فسفات 2/0 مولار 8= pH بصورت محلول درآورده شد (resuspension).
محلول حاصل در یک حمام آب برای 15 دقیقه جوشانده شده و در نهایت بااولتراسانتریفوژ g ×50000 در شرایط خلاء و دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه سانتریفوژ شد. رسوب دور ریخته شده و محلول بدست آمده برای اعمال بعدی در 70- درجه سانتیگراد نگهداری شد (9-7).
خالص سازی آنتی ژن B بوسیله ستون کروماتوگرافی پروتئین A
برای ایجاد تعادل درستون های کروماتوگرافی آماده، دو براب حجم ستون، بافر شروع کننده یا Start buffer از ستون عبور داده شد. تنظیم بافر ورودی و خروجی انجام گرفت. نمونه بر اساس 7/7 از ستون کروماتوگرافی عبور داده شد بطوریکه درهر لوله حدود 400-200 میکرولیتر محلول وجود داشت. بافر فسفات به میزان 5 حجم از ستون عبور داده شد و جمع آوری نمونه ها از ستون انجام گرفت (Pharmacia Biotech 71-7002-00).
جداسازی آنتی ژن پروتواسکولکس: حجم مورد نظر( 200) از پروتواسکولکس ها در دمای 4 درجه سانتیگراد هموژنیزه شد. این محلول بوسیله سونیکاتور که روی 50 سیکل بر ثانیه و ماکزیمم تن 30 ثانیه تنظیم شده بود در حمام یخ برای 4 بار سونیکه شد و در مرحله بعدی سانتریفوژ گردید. g) 30.10000 دقیقه) سپس محلول رویی از رسوب جدا شد. محلول حاصل در مقابل PBS دیالیز گردید (10)و سپس سنجش پروتئین به روش برادفورد انجام شد (11)
دات بلاتینگ: در این روش Load کردن آنتی ژن های B و پروتواسکولکس بروی کاغ نیتروسلولز انجام گرفت. سپس از یک محلول Blocking برای پوشش دادن قسمتهای خالی کاغذ نیتروسلولز استفاده شدکه این محلول BSA+PBS-T 1% است. با اضافه کردن سرم حاوی آنتی بادی (با رقتی معادل 100: 1 با (PBS-T بر علیه آنتی ژن مرد نظر، اتصال آنتی بادی آنتی هیومن آنتی بادی کونژوگه (آنتی هیومن [DAKO P0214] HRO با رقتی معادل 1500 : 1 بار (PBS-T به کاغذ نیتروسلولز اتصال آن به کمپلکس ایمنی انجام گرفت و در مرحله آخر برای رنگ آمیزی کاغذ نیتروسلولز ابتدا 5 میلی گرم از دی آمینوبنزیدین (DAB) با 5 میلی لیتر از PBS-T حل کرده و به آن 5 میکرولیتر آب اکسیژنه اضافه شد و کاغذ نیتروسلولز در این محلول غوطه ور گردید که ظرف 1 دقیقه رنگ در خانه ها ظاهر گردید. برای متوقف کردن واکنش بعد از خالی کردن محلول فوق، آب مقطر به کاغذ نیتروسلولز اضافه گردید (12.13).
اطلاعات بدست آمده با استفاده از آزمون آماری x2 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
شامل 16 صفحه فایل word قابل ویرایش
دانلود تحقیق بررسی ارزش تشخیصی آنتی ژن B و آنتی ژن پروتواسکولکس کیست هیداتیک با استفاده از روش دات بلاتینگ