پایان نامه بررسی روابط ژنتیکی ارقام و پایه‌های سیب با استفاده از نشانگر مولکولی SSR

اختصاصی از یارا فایل پایان نامه بررسی روابط ژنتیکی ارقام و پایه‌های سیب با استفاده از نشانگر مولکولی SSR دانلود با لینک مستقیم و پرسرعت .

فرمت فایل : WORD , PDF

تعداد صفحات: 90

پایان نامه کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی کشاورزی (M.Se)

موضوع:
بررسی روابط ژنتیکی ارقام و پایه‌های سیب با استفاده از نشانگر مولکولی SSR

فهرست مطالب:
عنوان    صفحه
چکیده:    1
مقدمه    2
فصل اول    3
بررسی منابع و کلیات    3
1-1- تاریخچه و گسترش سیب در جهان    4
2-1- درخت سیب و خواص بتانیکی آن    5
3-1- فرآورده‌های سیب    6
4-1- خواص دارویی سیب    6
5-1- ارزش غذایی سیب    7
6-1- پایه‌های سیب    8
1-6-1-پایه‌های بذری    8
2-6-1- پایه‌های رویشی(غیر بذری)    9
1-2-6-1-پایه‌های مالینگ    9
2-2-6-1- پایه های مالینگ مرتون    10
3-2-6-1-پایه های بوداگوسکی    11
7-1- زیست شناسی مولکولی    11
1-7-1- نشانگر    11
2-7-1- هدف از کاربرد نشانگر    11
3-7-1- انواع نشانگرهای ژنتیکی    12
1-3-7-1- نشانگرهای ریخت‌شناسی (مورفولوژیکی)    12
2-3-7-1- نشانگرهای سیتوژنتیکی    12
3-3-7-1- نشانگرهای ملکولی در سطح پروتئین    12
4-3-7-1- نشانگرهای مولکولی در سطح  DNA    13
5-3-7-1- انواع نشانگرهای DNA    14
الف) نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR                                   14
- تفاوت طول قطعات حاصل از هضم (RFLP)     14
-  تعداد متفاوت ردیف‌های تکراری و ماهوارک‌ها (VNTR   & Minisatellites)     15
-  پویش ژنومی نشانه‌های هضم (RLGS)     15
ب) نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR    15
4-7-1- ردیف‌های تکراری    17
1-4-7-1- ماهواره‌ها    18
2-4-7-1- ماهوارک‌ها    18
3-4-7-1- ریز ماهواره‌ها (میکروستلایت‌ها یا SSR)    19
5-7-1- چگونگی ایجاد میکروستلایت‌ها    20
6-7-1- خصوصیات نشانگرهای SSR    20
7-7-1- کاربردهای نشانگرهای SSR    21
8-7-1- مزایای ریز ماهواره ها    21
9-7-1- معایب ریز ماهواره‌ها    22
10-7-1- اساس چند شکلی در جایگاههای ریزماهواره    23
1-10-7-1-  مدل کراسینگ اور نا متقارن (UCO)     23
2-10-7-1- مدل سر خوردن پلیمراز هنگام همانند سازی(SSM)    24
8-1- واکنش زنجیره ای پلیمراز    24
1-8-1- اجزای واکنش PCR    24
1-1-8-1- آنزیم    24
2-1-8-1-مخلوط ذروکسی نوکلئوتید تری فسفات ( dNTPs )    25
3-1-8-1-  DNA الگو    25
4-1-8-1-  آغازگرها    25
5-1-8-1- بافرها و کلرید منیزیوم    26
2-8-1- عوامل مؤثر براختصاصی بودن واکنش PCR    26
1-2-8-1- غلظت مخلوط  PCR    26
2-2-8-1- دما    27
3-2-8-1- تعداد و طول سیکل    27
4-2-8-1- افزاینده های PCR    27
3-8-1- (TD-PCR) Touch Down PCR    27
4-8-1- PCR  آشیانه ای    28
9-1- الکتروفورز ژل آگارز    28
10-1- الکترفورز ژل پلی آکریل آمید    29
11-1- مروری بر تحقیقات انجام شده توسط نشانگر SSR    29
فصل دوم    31
مواد و روشها    31
1-2- مواد گیاهی    32
2-2- استخراج DNA    36
1-2-2- استخراجDNA به روش دلاپورتا    36
2-2-2- استخراج DNA به روش  CTAB    37
3-2- تعیین کیفیت نمونه های DNA    38
4-2- تعیین کمیت نمونه های DNA    39
5-2- PCR    39
1-5-2- اجزای واکنش  زنجیره‌ای پلیمراز    39
1-1-5-2- آغازگرها    39
2-1-5-2- آنزیم Taq DNA polymerase    40
3-1-5-2- بافر PCR    41
4-1-5-2- کلرید منیزیوم    41
5-1-5-2- dNTP    41
2-5-2- بهینه سازی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز    42
6-2- الکتروفورز فراورده های PCR    43
1-6-2- الکتروفورز افقی در ژل آگارز    43
2-6-2- الکتروفورز عمودی در ژل پلی آکریل آمید    43
1-2-6-2- تیمار شیشه‌ها    44
2-2-6-2- تزریق ژل    44
3-2-6-2- گرم نمودن ژل    45
4-2-6-2- واسرشته سازی محصولات PCR    45
3-6-2 رنگ آمیزی ژل    46
7-2- تجزیه و تحلیل داده ها    47
1-7-2- امتیازدهی باندها    47
2-7-2- تجزیه خوشه ای    48
3-7-2-تعیین اندازه باندها و الگوی نواربندی اختصاصی    48
فصل سوم    49
نتیجه گیری و بحث    49
1-3- نتایج استخراج DNA    50
2-3- بهینه سازی دمای اتصال آغازگرها    52
3-3- بهینه سازی روش PCR    52
4-3- بررسی نهایی نتایج حاصل از PCR    52
5-3- بررسی چند شکلی های SSR    54
6-3- بررسی و تحلیل روابط خویشاوندی بین ارقام    57
7-3- تعیین شناسنامه ژنتیکی برای ارقام    60
7-3- تعیین شناسنامه ژنتیکی برای ارقام    61
1-7-3- تعیین آللهای اختصاصی    61
2-7-3- الگوی نواربندی اختصاصی در ارقام    61
8-3- بررسی میزان خویشاوندی بین پایه ها    64
9-3- تعیین شناسنامه ژنتیکی برای پایه ها    65
1-9-3- تعیین آللهای اختصاصی    65
فصل چهارم    68
نتیجه گیری کلی و پیشنهادات    68
نتیجه گیری کلی    69
پیشنهادات    70
ضمائم    71
منابع و مآخذ:    75
 

چکیده:
ثبت و شناسایی ارقام و پایه های گیاهی و تعیین رابطه ژنتیکی بین آنها مستلزم دسترسی به روشهای دقیق و قابل تکراری که از شرایط محیطی متأثر نباشد، می باشد. روشهای سنتی تعیین هویت بر اساس مشاهده ظاهری درخت و میوه است.  با توجه به اینکه بسیاری از خصوصیات ظاهری تحت تأثیر عوامل محیطی قرار می گیرند، این روش قابل اعتماد نیست.
با استفاده از نشانگرها در سطح ملکول DNA می توان اطلاعات دقیقی از ژنوم گیاهان بدست آورد.از جمله نشانگرهای معتبر در بررسی ژنوم سیب، نشانگر SSR است که بدلیل تکرارپذیری بالا، ایجاد الگوی باندی نسبتاً ساده و توارث همبارز در بررسی تنوع ژنتیکی و شناسه دار کردن ارقام و  پایه های سیب کارایی بالایی دارد.
در بررسی حاضر از 5 جفت نشانگر پلی مورفیک SSR بر روی 24 رقم و پایه سیب بمنظور تهیه شناسنامه ژنتیکی برای بعضی از ارقام و پایه ها و همچنین تعیین رابطه ژنتیکی بین آنها استفاده شد. نمونه های برگی از کلکسیون سیب جمع آوری و DNA آنها استخراج شدند و سپس با استفاده از نشانگرهای اختصاصی SSR مورد تکثیر قرار گرفتند.  پس از الکتروفورز عمودی در دستگاه توالی یاب  DNA در ژل پلی آکریل آمید و رنگ آمیزی نیترات نقره در مجموع 52 آلل پلی مورفیک در 5 لوکوس ریزماهوار ( میانگین 4/10 در هر لوکوس) شناسایی شدند.  تجزیه کلاستر بطور جداگانه برای ارقام و پایه ها بر اساس حضور و عدم حضور باند با استفاده از برنامه NTSYS و ضریب تشابه Dice  مبتنی بر UPGMA انجام گرفت.  دندوگرام حاصل از ارقام نشان داد که ارقام مورد بررسی تنوع زیادی داشتند و در 6 کلاستر جای گرفتند و سیبهای گلاب مورد بررسی توسط این 5 جفت نشانگر از هم تفکیک شدند.  در دندوگرام پایه ها شباهت دو پایه MM111و  MM106 مشاهده گردید.
با استفاده از 3 آغازگر (CH01H01,02B1,CH02B10) باندهای اختصاصی در ارقام (24 رقم) مشاهده شد. همچنین اگوی نواربندی اختصاصی برای بعضی از ارقام در هر آغازگر بدست آمد.  در نهایت این 5 آغازگر توانستند آللهای اختصاصی مربوط به پایه ها را تعیین کنند.



مقدمه   
مهمترین درختان میوه ای که در مناطق معتدله و سردسیری به صورت اهلی درآمده‌اند در خانواده گلسرخیان  قرار دارند مانند سیب، گلابی، آلوچه، گیلاس و..... .  سیب از نظر اقتصادی بیشترین اهمیت را در بین محصولات درختی مناطق معتدله و سردسیری دارد و تعداد زیادی از ارقام تجاری آن به دلیل گرده‌افشانی باز، تلاقی‌های کنترل شده و یا تلقیح موتاسیون سوماتیکی با ارقام سازگار، قابل استفاده در برنامه‌های اصلاحی اند. یک مشکل قابل توجه در صنعت سیب و فراورده های آن تعیین هویت ارقام آن می‌باشد. روشهای سنتی تعیین هویت بر اساس مشاهده ظاهری درخت ومیوه است. با توجه به اینکه بسیاری از خصوصیات ظاهری تحت تأثیر عوامل محیطی قرار  می گیرند، این روش، قابل اعتماد نیست. روش دیگر برای تعیین هویت ارقام استفاده از نشانگر می باشد. استفاده از نشانگرها در سطح مولکول DNA  دقیق ترین روش بررسی است که جزئیات بیشتری از ژنوم ارقام سیب را ارائه می‌دهد. ازجمله نشانگرهای معتبردر بررسی ژنوم سیب، نشانگر  SSRاست که به دلیل قابلیت تکرارپذیری بالا، ایجاد الگوی باندی نسبتاً ساده و توارث هم بارز، در بررسی تنوع ژنتیکی و شناسه دار کردن ارقام سیب کارایی بالایی دارد. در این تحقیق با استفاده از نشانگرهای منتخب SSR تنوع ژنتیکی 29 رقم و پایه سیب و امکان دستیابی به نوارهای اختصاصی DNA در هر یک از ارقام و پایه ها مورد بررسی قرار گرفت.



فصل اول
بررسی منابع و کلیات
 
1-1- تاریخچه و گسترش سیب در جهان
سیب اهلی) ( Malus domestica Borkh از گونه‌های وحشی موجود در آسیا و اروپا به دست آمده است و قدمت کشت و پرورش آن به سالهای ماقبل تاریخ می‌رسد. طبق مدارک باقیمانده موجود در حدود 2000 سال قبل از میلاد، درختان سیبی که از جنگل‌ها انتخاب و به وسیله بذر ازدیاد شده بودند، در دهکده‌های ماقبل تاریخ کشت می‌شده اند. طبق کشفیات اخیر، ساکنین اطراف دریاچه‌های شمال اروپا و قسمتی از سوئیس، از سیب خشک‌کرده به عنوان غذا استفاده می‌کردند. بقایایی از سیب و گلابی خشک شده در بین آثار باقیمانده از این دهکده‌های ابتدایی در این نواحی مؤید این نظریه است. مدارک نوشته شده موجود حاکی از این است که در سالهای 600 قبل از میلاد یا حتی جلوتر از آن پرورش سیب در یونان متداول بوده است. از زمان تئوفراستوس دانشمند گیاهشناس روم قدیم (حدود 225 قبل از میلاد) ارقام متعددی از سیب در رم مورد ازدیاد قرار گرفته بود. سیب از بخش غربی آسیا و جنوب روسیه (قفقاز) و اروپا ابتدا به صورت بذر و دانه و بعدها پاجوش و پیوند در اروپا و آسیا منتشر گردیده است. بذور اولیه و هتروژن سیب منشأ واریته‌های جدیدی شدند که افراد علاقمند و با دقت، بهترین آنها را انتخاب و به طریق پاجوش یا پیوند ازدیاد کردند. با وجود قدمت کاشت سیب و شناختی که در ایران زمین به این درخت زیبا و میوه مطلوب وجود داشته و در ادبیات ما از آن بسیار یاد شده است، سیب تا این اواخر هیچ وقت به عنوان یک محصول اقتصادی و تجاری تلقی نشده است. این وضع در اروپا نیز تا اواسط قرن 19 و اوایل قرن بیستم وجود داشته است. بعد از احداث راههای جدید ارتباطی بین مراکز عمده تولید و بازارهای مصرف و بالارفتن قدرت خرید مردم و پی‌بردن به محسنات بهداشتی و غذایی آن، و بالاخره با به وجود آمدن صنایع تبدیلی، سیب به صورت یک محصول عمده اقتصادی در جهان شناخته شد.  در ایران این تحول خیلی دیر شروع شد. در واقع در طول سی‌سال اخیر بود که سیب به صورت تجاری در ایران کاشته شد و محصول آن به بازارها عرضه گردید (18).



2-1- درخت سیب و خواص بتانیکی آن
درخت سیب از خانواده گلسرخیان و جنس مالوس( Malus) و دارای ارقام مختلفی می‌باشد (13).   350 گونه مختلف سیب در دنیا شناخته شده که مهمترین آنهاM. sylvestris Mill ¸ M.Pumila Mill                 Borkh M.domestica می‌باشند. اکثر ارقام اهلی و تمام پایه‌های پاکوتاه سیب که از طریق غیرجنسی تکثیر می‌شوند به M. pumila Mill تعلق دارند (7).  منشاء  پیدایش سیب  اهلی (M.domestica) نامشخص است گرچه عده‌ای از  گیاهشناسان معتقدند که  سیب  اهلی از M. pumila Mill مشتق  شده  است (45).  عدد پایه کروموزومی سیب برابر 17، (n=17) می‌باشد. درخت سیب تابع آب و هوای سرد معتدل با نیاز سرمایی متوسط است. خاک مناسب برای پرورش آن، رسی شنی حاصلخیز با عمق کافی و pH خنثی است. ریشه گیاه با توجه به نوع بافت خاک، واریته و اثرات متقابل عوامل محیطی، می‌تواند چندین متر در خاک فرو رود. بیشترین رشد ریشه‌ها در بهار از زمان بازشدن جوانه‌ها تا خرداد ماه است.  ریشه مطلوب در عمق و شعاع متعادل و متناسبی منشعب می‌شود و تمام حجم خاک در دسترس خود را برای به دست آوردن آب و مواد غذایی مورد بهره‌برداری قرار می‌دهد.  ساقه درخت، قابلیت انعطاف‌پذیری و پرورش نهایی به انواع فرم‌ها را دارد (13).  بعضی از ارقام سیب تمایل بسیار به تولید پاجوش دارند. رنگ پوست شاخه های درخت سیب از زرد تا قرمز متغیر و اکثراً قهوه ای است. تاج  درخت متنوع، در بعضی ارقام چتری و درهم و در بعضی دیگر باز، کم شاخه، هرمی، مستطیلی، استوانه ای با شاخه های عمودی موازی یا بینابین است.  زاویه شاخه های اصلی با تنه در بعضی ارقام قائمه ودر بعضی دیگر تنگ و حاده است. ریشه نیز بر حسب گونه ها وارقام از رشد و فرم متفاوتی برخوردار است. ریشه اکثریت درختان از بذر بوجود آمده گونه سیب معمولی (M.communis) در  عمق 15 سانتی متری تا 20/ متری قرار دارند. حدود گسترش افقی ریشه ها بر حسب ارقام و چگونگی شرایط خاک از چند سانتی متر تا چند متر است. ریشه سیب به هوا و اکسیژن زیاد نیاز دارد.  جوانه های درخت سیب به دو نوع جوانه برگ و گل تقسیم می شوند. جوانه های برگی همه ساله در طول شاخه های جوان در بغل برگها در بهار بوجود می آیند و جوانه های گل همیشه در انتهای شاخکهای کوتاه که به سیخک  معروفند ظاهر می شوند. طول این شاخکها بر حسب نوع رقم، سن ، طول عمر باردهی درخت و مواد غذایی حدود    15- 10 سانتی متر است. درخت سیب بیشتر از سایر درختان میوه به باردهی متناوب تمایل داردوچنانچه در یکسال  بار زیادی داشته باشند، در سال بعد بی بار یا کم بار خواهند شد. ولی این قاعده کلی نیست و ارقامی پیدا می شوند که همه ساله بار متعادلی می آورند. تاج درختان سیب از 2 الی 10 متر گسترش و 5/1 الی 8 - 7 متر ارتفاع دارد(18 ).

3-1- فرآورده‌های سیب
محصولاتی که در حال حاضر از سیب به دست می‌آیند عبارتند از آب سیب، کنستانتره، شهد سیب، کمپوت، انواع مربا، سس سیب، سیدر ،  سرکه ترشی و الکل.  علاوه بر محصولات مزبور می توان سیب را به قطعات کوچک بریده و پس از خشک کردن بدون بیم از فساد آن، مدتهای طولانی آنها را نگهداری نمود.  این محصول مورد استفاده ارتشهای دنیا است.   در آمریکا پنج نوع فرآورده اصلی از سیب تولید می‌شود که شامل آب سیب، سس سیب، کمپوت سیب، برگه سیب و سیب یخ‌زده است. آب سیب و سس و کمپوت آن بیش از سایر فرآورده‌های دیگر تولید می‌شود و مقدار تولید این فرآورده‌ها نیمی از کل تولیدات آنرا  تشکیل می‌دهد. مقداری از سیب تولیدی به مصرف تهیه سرکه، ژله، کره سیب و ورقه های تازه می‌رسد. همچنین مقدار کمی نیز به شراب، اسانس، سیب کامل تنوری، حلقه سیب و شهد سیب تبدیل می‌شود (10). صنایع تبدیلی سیب در دنیا از ارزش افزوده بسیار بالایی در اقتصاد برخوردارند و حجم مبادلات و کالاهای ساخته شده از سیب به تنهایی به میلیاردها دلار بالغ می‌شود.  متأسفانه در ایران به این صنایع بسیار اندک توجه شده و هنوز حجم کار آنها بسیار کوچک است (18).

4-1- خواص دارویی سیب
سیب ضدعفونی کننده دهان است و اسید اوریک و دیگر سمومی که در بدن جمع شده‌اند را حل کرده و غدد بزاق دهان و شیره معده را تقویت می‌کند.  سیب سنگ کیسه صفرا و کلیه‌ها را حل می کند و تب حاصل از گریپ و سرماخوردگی را فرو می‌نشاند. ضد وباست و برای امراض حصبه‌ای و اسهال خونی و ورم امعاء بسیار نافع است و مانع سوءهاضمه بوده و بدین ترتیب کار معده را تنظیم می‌کند. از آرد سیب برای جلوگیری از خون دماغ و رفع سموم  (اسید اوریک، کلسترول) استفاده می‌شود.  سیب برای درمان بیماریهای کبدی، معدی، مجاری ادرار و سینه درد نیز نافع است و به دلیل داشتن فسفر موجب تقویت اعصاب و مغز می‌شود.  سیب برای مبتلایان به مرض مفاصل زیاد تجویز می‌شود. از سیب به عنوان پماد زخم‌ها استفاده می‌شود و عقیده بر این است که کلمه پماد از کلمه Pome که به معنی سیب است مشتق شده است.  از سیب برای تهیه مرهم به منظور آرام کردن درد در مواقعی که ضربه‌ای به چشم وارد شده و نیز جهت تخفیف درد گوش استفاده می‌گردد. دم کرده شکوفه درخت سیب انواع سرفه را آرام می‌نماید. سیب مقوی دل و دماغ و جگر بوده و برای خفقان و تنگی نفس مفید است. شربت سیب برای دفع سموم و تفریح قلب بسیار مؤثر است (2 و4).