دانلود مقاله کامل درباره الایزا

اختصاصی از یارا فایل دانلود مقاله کامل درباره الایزا دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

لینک دانلود و خرید پایین توضیحات

فرمت فایل word  و قابل ویرایش و پرینت

تعداد صفحات: 19

الایزا

امروزه الایزا[1] بعنوان یکی از قدرتمندترین روشهای آزمایشگاهی – تحقیقاتی در جهان مطرح می‌باشد.  همانگونه که خواهیم دید این روش از حساسیت[2] و اختصاصیت[3]  بسیار بالایی برخوردار است تا بدانجا که هم‌ اکنون روش اصلی در زمینه‌ های مختلف علوم حیاتی از شناسایی و تشخیص ویروسها، باکتری‌ها و انگل‌های پروتوزوا و متازوآ گرفته تا شناسایی مقادیر بسیار کم هورمونها و مولکولهای حیاتی در پزشکی بالینی و آزمونهای تحقیقاتی می‌باشد .

 علاوه براین از سال 1971 که اولین آزمونهای مبتنی بر آنزیم‌های متصل به آنتی‌بادی توسط پرلمان و انگوال شرح داده شد صدها روش کارآمد براساس اصول اولیة الایزا برای شناسایی تعداد بسیار زیادی از ماکرومولکولهای بیولوژیک طراحی و با موفقیت اجرا شده است. امروزه بسیاری از کیت‌های تشخیص بیماریها براساس روش الایزا بنا شده‌اند و سود شرکت‌های بزرگ و معتبر تشخیصی، از محصولات مبتنی بر روش الایزا به میلیون‌ها دلار می‌رسد.

قبل از ورود به مباحث اصلی یک نوع الایزای ساده والبته بسیار رایج بصورت مختصر شرح داده خواهد شد تا فراگیر قادر باشد یک دورنمای کلی از روش الایزا در ذهن خود ترسیم کند.

علامت‌های اختصاری رایج را که بطور گسترده مورد استفاده قرار خواهیم داد مرور می‌نمائیم.

آنتی‌ژن = Ag

آنتی‌بادی = Ab

آنتی‌بادی اولیه = Ab1

آنتی‌بادی ثانویه = Ab2

آنزیم = E

آنزیم متصل شده به آنتی‌بادی = آنتی‌بادی متصل شده به آنزیم = *E = *Ab

آنتی‌بادی علیه آنتی‌بادی دیگر = Anti – Ab

سوبسترای آنزیم = S

سنجش رنگ بدست آمده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر = Read

فاز جامد = I

تست الایزا (ELISA)

تست الایزا را در حالت معمول برای ردیابی آنتی ژن یا آنتی بادی بکار می برند بدین ترتیب که یکی از این دو ماده در بستر جامد ثابت می شود و برای ردیابی دومی بکار گرفته می شود، اما اساسا برای ردیابی هر جفت ماده ای که مثل جفت آنتی ژن و آنتی بادی به هم گرایش داشته و قدرت اتصال مناسبی نسبت به هم دارند میتواند بکار گرفته شود (مثلا لکتین به لیگاند مربوطه اش یا مولکول به گیرنده اختصاصی اش) البته این پدیده یعنی اتصال بین دو ماده ای که آنتی بادی و آنتی ژن نیستند اما گرایش به هم دارند اغلب اوقات مشکل آفرین است و برای بالا بردن حساسیت و اختصاصیت اتصال بین آنتی بادی و آنتی ژن در الایزا باید این اتصالات ناخواسته را به طریقی مهار کرده و یا کارهای جبرانی لازم را در نظر گرفت.

1 ) تست الیزا برای جستجوی آنتی ژن:

ELISA روش بسیار حساسی است که (معمولا) برای جستجوی آنتی ژن یا آنتی بادی بکار میرود در تحت شرایط تنظیم شده (از نظر غلظت یونی و pH) پروتئین ها (آنتی ژن یا آنتی بادی) به طور خودبخود تمایل دارند که به بستر جامد (در این تست plate هایی از جنس پلی استیرن) متصل شوند، ماهیت این اتصال بخوبی معلوم نشده است اما برگشت پذیر بوده و با استفاده از pH های بالاتر یا پایین تر و استفاده از غلظت های یونی بالا اتصال قطع میشود این نوع اتصال خودبخودی اگر چه ظرفیت محدودی دارد ولی با بکارگیری سیستم های تقویتی مناسبی مثل سیستم آنزیم-سوبسترا این اتصالات وسیله بسیار خوبی برای طراحی سیستم الایزا گردیده است.

برای انجام الایزا:

1 ) ابتدا باید پروتئین مورد نظر را به کف پلیت چسباند.

2 ) نقاط اتصال باقی مانده را باید با محلول پروتئینی مناسب مسدود کرد.

3 ) محلول مورد آزمایش را اضافه کرد تا دو ماده همدیگر را پیدا کرده و متصل شوند

4 ) سیستم های تقویتی اولیه را برای افزایش حساسیت آزمایش بکار گرفت

5 ) سیستم آنزیمی نهایی را به راه انداخته و رنگ نهایی تولید شده را اندازه گرفت

حال این 5 مرحله به تفکیک توضیح داده می شوند:

1 ) اتصال پروتئین به کف پلیت (Coating):

آنتی ژن (یا آنتی بادی) در مقادیری در حدود میکروگرم به داخل چاهک پلیت الایزا اضافه شده و فرصت داده میشود تا به مقدار کافی به کف چاهک (well) متصل شود برای اینکار بسته به نوع پروتئین بافرهای مختلفی به کار گرفته می شود و غلظت پروتئین نیز باید مناسب سازی شود در مقادیر بسیار پایین حساسیت ردیابی پایین می آید و در مقادیر بالای آنتی ژن اتصالات سستی نیز برقرار میشود که در مراحل بعدی کنده شده و هنگام شستشو آنتی ژن همراه با آنتی بادی اختصاصی دفع می شوند و لذا حساسیت تست مجددا پایین می آید.

بطور کلی این مرحله اساسی بوده و نقش زیادی در نتیجه نهایی دارد ایده آل های مورد انتظار برای این مرحله اینها هستند:

الف) مقدار آنتی ژن متصل شده به کف همه چاهک های یک پلیت باید یکنواخت باشند و کمترین واریانس را در نتیجه ایجاد کنند، بدین معنی که وقتی یک نمونه واحد را در چند چاهک مختلف منتقل نموده و آزمایش کنیم باید نتایج بدست آمده به هم نزدیک بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنین اگر آزمایش مورد نظر در حجم بالا انجام میگیرد و چند پلیت را هم زمان کوت نموده و استفاده میکنیم باید جنس پلیت ها و شرکت تهیه کننده آنها یکسان باشد تا از خطای مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پلیت ها جلوگیری شود و ترجیحا بافر کوتینگ و زمان کوتینگ و محلول آنتی ژنی آماده شده برای کوتینگ بهتر است یکسان باشند.

ب) اتصالات برقرار شده بین آنتی ژن و بستر جامد باید به اندازه کافی محکم و قوی باشند تا در مراحل شستشوی بعدی کنده نشوند، معمولا برای آنتی ژن های عادی، اتصال دهنده اضافی لازم نیست ولی اگر آنتی ژنی استثنائاً با روش معمول به کف پلیت نچسبید یا اتصالات سستی برقرار کرد از مواد و روش های خاصی برای اتصال آنتی ژن به کف بستر استفاده می شود (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئید یا اشعه ایکس یا ...).

ج) پروتئین متصل شده نباید آنقدر کم باشد که نتواند مقادیر بالای آنتی بادی را جذب کند در این صورت غلظت های بالای آنتی بادی قابل تشخیص نخواهد بود از طرفی پروتئین متصل شده نباید آنقدر زیاد باشد که اتصالات غیراختصاصی از اتصالات اختصاصی بیشتر شوند که در این صورت جواب آزمایش قابل اغتماد نخواهد بود

برای تامین این سه هدف تمهیدات خاصی به کار گرفته می شوند که در فرصتی مناسب توضیح داده خواهند شد

2 ) مرحله مسدود سازی یا بلوکینگ (blocking):

نقاطی از کف پلیت که با پروتئین اختصاصی پوشانده نشده اند با استفاده از محلول های پروتئینی خنثی (از این نظر که در واکنش اختصاصی بعدی اثر سوئی ندارد) پوشانده می شوند محلول های پروتئینی برای این منظور حاوی شیر کم چربی یا آلبومین گاوی یا ژلاتین و یا کازئین میباشند. علاوه بر پروتئین از دترژانت های غیر یونی خاصی نظیر Tween 20 یا Tween 80 یا ... نیز به عنوان کمکی استفاده می شوند نوع این مواد و مقادیر بکار برده شده به صورت تجربی تعیین می شوند و با توجه به تجربیات دیگران می توان محدوده خاصی را برای کار مورد نظر امتحان کرد و بهترین غلظت را بدست آورد (چون پروتئین ها از ریشه های جانبی متفاوتی برخوردارند لذا برای پروتئین های بسیار خالص مثل پروتئین های ریکامبینانت مناسب سازی این ترکیبات در بالا بردن اعتبار نتایج بسیار کمک کننده خواهد بود). علاوه بر پروتئین و دترژانت، غلظت یونی بافر بلوک کننده نیز اهمیت زیادی دارد و برای اتصال انتخابی پروتئین مورد نظر (از میان مخلوط پروتئینی) میتوان بافرهای مختلف و غلظت یونی متفاوت را ارزیابی کرده و بهترین بافر را برای آزمایش مورد نظر بدست آورد.